Einstieg in die Biotechnologie
Kapitel:
1. Was ist Biotechnologie? Was ist Gentechnik?
2. Zellen, Gene, Proteine: Ein Ausflug in den Mikrokosmos
Dieses Kapitel erklärt zunächst die Begriffe „Biotechnologie“ und „Gentechnik“ und gibt eine kurze Übersicht über historische Meilensteine der Forschung, die das Wesen der heutigen Biotechnologie geprägt haben. Als Basis für das Verständnis der verschiedenen biotechnologischen Anwendungsfelder eröffnet es einen Einblick in den Mikrokosmos der Gene und Eiweißstoffe und stellt einige grundlegende Methoden der molekularen Biologie vor.
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 Die Mikroskopie gewährt ein Verständins der Leistung von Mikroorgansimen. |
1. Was ist Biotechnologie? Was ist Gentechnik?
Die Mikroskopie gewährte ein erstes Verständnis der Leistungen von Mikroorganismen. Täglich begegnen wir Verfahren und Produkten der Biotechnologie in den unterschiedlichsten Bereichen des Lebens: Brot, Milcherzeugnisse wie Joghurt oder Käse oder alkoholische Getränke wie Bier und Wein sind hierbei die „klassischen“ Beispiele. Treibende Kraft für ihre Herstellung sind Mikroorganismen: z. B. Milchsäure- und Essigsäurebakterien, Hefen und Pilze, die bereits vor 6.000 Jahren von Menschen genutzt wurden. Freilich kannte man damals die zugrunde liegenden biochemischen Prozesse noch nicht.
Die Erkenntnis, dass Mikroorganismen für eine Vielzahl von Stoffumwandlungen verantwortlich sind, gewannen Wissenschaftler wie Louis Pasteur erst im 19. Jahrhundert mit Hilfe der Mikroskopie und der Biochemie.
Der Begriff „Biotechnologie“ wurde 1919 erstmals von dem ungarischen Ingenieur Karl Ereky geprägt und als Summe aller Verfahren beschrieben, mit denen Produkte aus Rohstoffen unter Zuhilfenahme von Mikroorganismen erzeugt werden.
Der modernen Biotechnologie wird diese Definition allerdings nicht mehr gerecht. Sie nutzt sowohl Mikroben als auch höhere Organismen beziehungsweise deren Bestandteile und ist mittlerweile als Querschnittstechnologie sowohl in der Grundlagenforschung als auch in den Anwendungsbereichen Medizin, Land- und Ernährungswirtschaft sowie im Umweltschutz etabliert. Zudem wird sie von einer Vielzahl anderer Wissenschafts- und Technologiefelder beeinflusst. Hierzu zählen z. B. Chemie, Physik, Verfahrenstechnik, Materialwissenschaften oder Informationstechnologie.
Einige Beispiele: Neue Kunststoffe haben die Möglichkeiten der Kultur von Zellen und Geweben in der Grundlagenforschung deutlich verbessert. In der Arzneimittelherstellung werden Wirkstoff produzierende Zellen im industriellen Maßstab mit Hilfe ausgeklügelter Prozesstechnik kultiviert und überwacht. „Biochips“ als Instrumente der Diagnostik, z. B. in Medizin und Verbraucherschutz, sind an der Schnittstelle zwischen Molekularbiologie und Halbleitertechnik entstanden. In der medizinischen Diagnostik oder im Umweltschutz verbinden Biosensoren biochemische Reaktionen mit exakten elektronischen Messverfahren. Von großer Bedeutung sind biotechnologisch gewonnene Enzyme (Eiweißstoffe, die chemische Reaktionen katalysieren). Sie kommen im industriellen Maßstab, z. B. in Bioreaktoren oder Filtersystemen, zum Einsatz. In den Bereichen Feinchemikalienherstellung, Lebensmittelverarbeitung, Abluft- oder Abwasserreinigung u. a. haben sie klassische physikalische und chemische Prozesse verdrängt, weil sie effizienter, ressourcenschonender und umweltfreundlicher arbeiten.
Gentechnik ist das Teilgebiet der modernen Biotechnologie, das alle Methoden und Verfahren zur Isolierung, Erforschung, Veränderung und Übertragung von Erbmaterial umfasst. Mit Erbmaterial ist hierbei eine chemische Substanz gemeint, die als DNA (englisch: desoxyribonucleic acid) oder DNS (deutsch: Desoxyribonukleinsäure) bezeichnet wird.
Grundlagen: Biotechnologie und Gentechnik (pdf - Poster)
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2. Zellen, Gene, Proteine: Ein Ausflug in den Mikrokosmos
Um die zentrale Bedeutung der DNA für alles Leben zu verstehen, ist eine Reise in den Mikrokosmos hilfreich. Im Abschnitt 2.1. ist bereits der Begriff Zelle gefallen: Zellen sind die kleinsten Einheiten, aus denen Lebewesen aufgebaut sind. Unser Körper z. B. besteht aus der fast unvorstellbaren Zahl von rund 60 Billionen dieser kleinen Einheiten, die jede für sich im Durchschnitt einen Durchmesser von einem hundertstel Millimeter haben.
Alle Zellen sind von einer dünnen Haut – der Zellmembran – umgeben, die sie gegen die Umwelt abgrenzt und gleichzeitig den Austausch mit dieser ermöglicht. Das Zellinnere ist wie in einer Fabrik in spezialisierte Kompartimente unterteilt und enthält Substanzen, die sich in einem ständigen
Auf-, Um- und Abbauprozess befinden. Bei den Zellen höherer Lebewesen liegt das Erbmaterial in Form mehrerer Fäden (Chromosomen) im Inneren eines abgegrenzten, kugelförmigen Bereichs, den man als Zellkern bezeichnet. Bakterien besitzen keinen Zellkern.
Aufbau und Funktion der Erbsubstanz DNA sind erst ab dem Ende des 19. Jahrhunderts erforscht und für die heutigen Anwendungen nutzbar gemacht worden:
Historische Übersicht
1886
Friedrich Miescher isoliert erstmals die chemische Substanz DNA aus weißen Blutkörperchen und beschreibt ihre Eigenschaften.
1909
Wilhelm L. Johanssen führt den Begriff „Gen“ ein. Er beschreibt die von Gregor Mendel definierten elterlichen Eigenschaften, die von den Eltern an die Nachkommen weitergegeben werden bzw. deren Neukombination über Generationen hinweg.
1944
Oswald Avery, Colin McLeod und Maclyn McCarty entdecken, dass DNA für die Übertragung vererbbarer Eigenschaften verantwortlich ist. Die Erbsubstanz DNA erlangt hierdurch erstmals wissenschaftliches Interesse, der Grundstein für die Gentechnik ist gelegt.
1953
James Watson und Francis Crick stellen in dem renommierten Wissenschaftsjournal „Nature“ ihre Ergebnisse aus der Erforschung der DNA-Struktur vor: DNA hat den Aufbau einer Doppelwendel (Doppelhelix) aus zwei umeinander gewundenen Einzelsträngen, die aus Phosphat, Zucker (Desoxyribose) und den vier Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) bestehen. Das Rückgrat der DNA wird durch das Zucker-Phosphat-Gerüst gebildet. An der Zuckereinheit setzt jeweils eine Base an, wobei sich immer nur die Basen A und T bzw. G und C in der Doppelhelix gegenüberstehen und durch chemische Kräfte (Wasserstoffbrückenbindungen) aneinander binden.
Watson und Crick erhalten 1962 für Ihre bahnbrechenden Arbeiten den Nobelpreis für Medizin.
1956
Francis Crick postuliert aufbauend auf vorangegangenen, wissenschaftlichen Erkenntnissen, dass Gene als informationstragende Abschnitte auf der DNA erst in die Zwischenstufe der RNA (englisch: ribonucleic acid) bzw. RNS (deutsch: Ribonukleinsäure) und ausgehend von dieser in Eiweißstoffe (Proteine) übersetzt werden.
Dieses Schema ist als zentrales Dogma der Molekularbiologie bekannt.
1962
Werner Arber entdeckt die Restriktionsenzyme. Dies sind Eiweißstoffe, die Bakterien einen Schutz vor eindringender DNA kleiner Viren gewährleisten. Sie zerschneiden DNA an definierten Basenabfolgen. Damit die bakterieneigene DNA unbehelligt bleibt, wird sie von anderen Enzymen des Bakteriums chemisch verändert.
1966
Severo Ochoa, Marshall W. Nirenberg, Heinrich Mattei und Har Gobind Khorana gelingt die Entschlüsselung des genetischen Codes: Die Reihenfolge der Basen auf der DNA legt ihren Informationsgehalt für die Übersetzung in ein Protein fest. Jeweils drei aufeinander folgende Basen (Triplett) tragen die Information für einen von 20 möglichen Eiweißbausteinen (Aminosäuren). Weitere Dreierkombinationen stehen für den Start und das Ende einer Eiweißkette.
Der genetische Code hat Gültigkeit für alle Lebewesen (Universalität des genetischen Codes). Daher ist es möglich, Gene auch über Artgrenzen hinweg zu übertragen und in anderen Organismen in funktionelle Eiweißstoffe übersetzen zu lassen. Proteine sind die eigentlichen Werkzeuge der Zelle.
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1972
Paul Berg gelingt es, mittels eines aus Bakterien isolierten „Scheren-Enzyms“ (Restriktionsenzym) DNA zu zerschneiden und mit einem „Klebe-Enzym“ (DNA-Ligase) wieder zu verbinden.
1973
Herbert Boyer und Stanley Cohen erzeugen mit Paul Bergs Technik ein neu kombiniertes Molekül aus der DNA eines Virus und eines Bakteriums und bringen es in Bakterien ein.
Dieser Zeitpunkt markiert die Geburtsstunde der gentechnischen Verfahren, wie sie noch heute praktiziert werden.
1982
Menschliches Insulin erhält als erstes gentechnisch hergestelltes Medikament die Marktzulassung.
1990
Die Mediziner French Anderson und Michael Blaese führen in den USA die weltweit erste somatische Gentherapie an der vierjährigen Ashanti DeSilva durch. Ashanti leidet an der angeborenen Immunschwäche ADA-SCID, bei der durch einen Gendefekt ein für die körpereigene Abwehr lebenswichtiges Enzym (Adenosin Desaminase, ADA) fehlt. Im internationalen Verbund des Human Genome Project beginnen Wissenschaftler mit der Entzifferung des gesamten menschlichen Erbguts.
2003
Das Human Genome Project ist abgeschlossen. Nach 13 Jahren Forschungsarbeit sind 99,9 % der „Buchstabenfolge“ (DNA-Sequenz) des menschlichen Erbmaterials bekannt.
Grundlagen: Zellen, Gene, Proteine (pdf - Poster)
Die Vielfalt der Erbinformation
50 Jahre lang galt unumstößlich das „zentrale Dogma der Molekularbiologie“, wonach ein Gen über die Bildung einer Boten-RNA in ein Protein übersetzt wird.
Diese Lehrmeinung kann heute streng genommen nur noch für Bakterien aufrecht erhalten werden. Inzwischen weiß man, dass der Informationsgehalt des Erbmaterials weit vielfältiger ist als ursprünglich angenommen. Bei höheren Organismen kann ein Gen in verschiedene Eiweiß-Varianten übersetzt werden.
Der Grund hierfür ist, dass die Eiweiß-kodierenden Bereiche der Gene (Exons) von „überflüssigen Einschüben“ (Introns) unterbrochen sind. Nach der Bildung der Boten-RNA müssen diese Einschübe zunächst entfernt werden (Spleißen). Da dies auf unterschiedliche Art und Weise geschehen kann (alternatives Spleißen), ergibt sich die Möglichkeit, aus den ca. 25.000 Genen
des Menschen rund 90.000 unterschiedliche Proteine zu bilden.
Ein durchschnittliches Proteingen des Menschen besteht aus:
• 28.000 Basenpaaren (bp)
• 8,8 Exons
• 7,8 Introns
• ein Exon besteht aus ca. 120 bp
• ein Intron besteht aus 100-100.000 bp
Aus einem Gen werden durchschnittlich 3,4 Proteine gebildet.
Mehr Komplexität durch RNA
Nicht alle Gene werden in Eiweiße übersetzt. Beim Menschen existieren mindestens ebenso viele Gene, deren RNA allein eine wichtige Funktion erfüllt. So sind RNAs bekannt, die ähnlich den Proteinen als Reaktionsbeschleuniger oder Signalüberträger wirken. RNAs übernehmen auch die Rolle molekularer Schalter. Sie nehmen z. B. Einfluss auf die Zellteilung, die Erhaltung von Stammzell-Eigenschaften (siehe Seite 54) oder den programmierten Zelltod (Apoptose). Daneben findet man auch kurze RNA-Stücke mit regulatorischer Funktion. Diese stammen entweder aus den Introns der Gene (Mikro-RNA) oder werden durch Ablesen des Gegenstrangs eines Gens gebildet (Antisense-RNA). Indem sich diese RNA-Stücke an die passende Boten-RNA eines Gens anlagern, entstehen kurze doppelsträngige RNA-Abschnitte, was letztendlich die Übersetzung in ein Protein verhindert. Auf diese Weise können auch Gene reguliert werden, die auf der DNA weit entfernt oder sogar auf einem anderen Chromosom liegen. In der Forschung macht man sich diesen Mechanismus der Genregulation zu Nutze, um gezielt einzelne Gene vorübergehend oder dauerhaft abzuschalten. Dadurch ist es möglich, die Wirkung von Genen unbekannter Funktion zu untersuchen. Langfristig erhofft man sich mit Hilfe der RNA-Interferenz neue Therapieformen gegen Virusinfektionen, Krebs und Erkrankungen des zentralen Nervensystems zu erhalten.
Die Informationen über der DNA-Ebene
– epigenetische Effekte
Lange Zeit konnten einige Erbkrankheiten nicht erklärt werden, weil sie nicht den Regeln der klassischen Vererbungslehre folgen und auch nicht auf Mutationen zurückzuführen sind. Ihre Ursache liegt nicht in der Abfolge der Bausteine A, T, G und C sondern in verschiedenen chemischen Veränderungen der DNA sowie der Proteine, die an die DNA angelagert sind. Diese sogenannten epigenetischen Veränderungen (griechisch epi = auf, dazu, nach) sind der Grund dafür, dass manche Krankheiten erst nach vielen Generationen wieder
auftreten, nicht zwangsläufig beide eineiige Zwillinge von diesen betroffen sind und bestimmte Formen von Krebs entstehen. Darüber hinaus spielen sie bei der Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle.
Im Gegensatz zur DNA-Sequenz ist das epigenetische Muster hoch dynamisch, d.h. es unterliegt einer ständigen Veränderung durch äußere Einflüsse. Verschiedene epigenetische Mechanismen sind bekannt. So können
einzelne Gene aber auch größere Abschnitte eines Chromosoms durch das Anheften von Methylgruppen (-CH3) stillgelegt werden. In Krebszellen konnte nachgewiesen werden, dass das Verteilungsmuster der chemischen Gruppen auf der DNA sich von dem in gesunden Zellen unterscheidet. Insgesamt trägt die DNA von Krebszellen weniger Methylgruppen. Dieses Phänomen bezeichnet man als Hypomethylierung. Gene, die normalerweise eine Tumorentstehung unterdrücken, sind in diesen Zellen übermäßig methyliert. Das gezielte Zurücksetzen des Musters in den ursprünglichen Zustand gesunder Zellen (epigenetische Reprogrammierung), könnte ein Angriffspunkt für neue Krebsmedikamente sein.
Die epigenetische Reprogrammierung der DNA spielt in der frühen Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle. Nach Befruchtung der Eizelle werden zunächst alle Methylgruppen von der DNA entfernt. Erst im Laufe der
folgenden Monate werden die typischen chemischen Veränderungen wieder eingeführt und somit vererbt. Welch drastische Auswirkungen Fehler in diesem epigenetischen Muster haben können, wird bei den Versuchen Tiere zu klonen deutlich (siehe Seite 68 – Tierzucht). Ein tief greifendes Verständnis der
Einführung und Erhaltung epigenetischer Muster ist nicht nur der Schlüssel für das erfolgreiche Klonen von Tieren, sondern auch für das Verständnis der Kontrolle zentraler Vorgänge bei der embryonalen Entwicklung des Menschen.
Auch die chemische Veränderung bestimmter DNA-bindenden Proteinen (Histone) hat Einfluss auf die Genaktivität. In regelmäßigen Abständen ist die DNA-Doppelhelix um Histonprotein-Komplexe gewickelt. Neben Methylgruppen können Histonproteine auch Acetyl- (CH3CO-) und Phosphatgruppen sowie das kleine Protein Ubiquitin tragen. Welchen Einfluss diese Veränderungen der Histone auf die Verpackung der DNA und letztendlich auf Genaktivität haben, ist noch weitgehend unklar. Bislang ist nur bekannt, dass das Anhängen von Acetylgruppen an Histone im Allgemeinen zu einem verstärkten Ablesen der benachbarten Gene führt. Man vermutet, dass auch ein Zusammenhang zwischen chemischen Veränderungen an den Histonen und der Entstehung von Krankheiten existiert.
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 Ein typischer Molekularbiologie-Arbeitsplatz! |
3. Alltag im Labor
Das Methodenspektrum, welches Forschern in der Biotechnologie heute zur Verfügung steht, ist schier unüberschaubar geworden. Dennoch gibt es einige Gemeinsamkeiten, auf denen alle Verfahren aufbauen.
Ausgangsmaterial sind in der Regel Zellen oder Gewebe, die aus einem Organismus oder der Laborkultur gewonnen werden. Um an ihre Inhaltsstoffe zu gelangen, werden chemische Substanzen oder physikalische Verfahren (z. B. Luftdruck) verwendet, um die Zellen aufzuschließen. Das erhaltene Substanzgemisch, darunter DNA und Proteine, muss nun verschiedenen Trennverfahren unterzogen werden, um an die Substanz bzw. das Substanzgemisch zu gelangen, womit gearbeitet werden soll. Getrennt wird in der Regel zunächst nach dem Verhalten im Schwerefeld einer Zentrifuge. Weitere Trennungen erfolgen nach Größe, Ladung, chemischen Eigenschaften (z. B. Löslichkeit in Gegenwart anderer Stoffe) etc. Am Ende der Arbeiten muss der Erfolg des Experiments sowie die Reinheit des gewonnenen Materials und dessen Menge bestimmt werden.
Hierzu drei Methodenbeispiele aus dem Laboralltag:
Polymerase-Kettenreaktion (englisch: Polymerase Chain Reaction, PCR)
Ausgehend von einer geringen Menge DNA werden gewünschte DNA-Abschnitte mit Hilfe eines DNA-Verdopplungs-Enzyms aus Hitze liebenden Bakterien (Taq-Polymerase) sowie in Gegenwart von DNA-Bausteinen und kurzen DNA-„Startermolekülen“ im Reaktionsgefäß in sich wiederholenden Temperaturschritten millionenfach kopiert.
Die PCR ist ein bahnbrechendes, analytisches Verfahren, das den Nachweis von DNA in geringsten Spuren erlaubt. Sein Erfinder, der amerikanische Wissenschaftler Kary B. Mullis, wurde hierfür 1993 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Als eine Methode des „genetischen Fingerabdrucks“ in der Gerichtsmedizin hat die PCR öffentliche Berühmtheit erlangt, sie zählt darüber hinaus aber zu den Standardverfahren in vielen medizinisch-diagnostischen und biotechnologischen Labors.
Spaltung mit Restriktionsenzymen
Die bereits erwähnten Restriktionsenzyme (in der Fachsprache auch Restriktionsendonukleasen genannt) sind wichtige Werkzeuge des Molekularbiologen zur Isolierung definierter DNA-Abschnitte oder zur Untersuchung der DNA-Basenabfolge (Sequenz). Diese Proteine binden und schneiden bestimmte Basenabfolgen einer doppelsträngigen DNA. Inzwischen sind mehrere hundert Restriktionsenzyme aus den verschiedensten Bakterien isoliert worden. Das wohl bekannteste unter ihnen ist Eco RI aus dem Bakterium Escherichia coli.
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 DNA-Banden im Agarose-Gel, mit einem Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht. |
Gel-Elektrophorese
Diese Methode erlaubt die Trennung von DNA-Fragmenten (gewonnen z. B. durch Spaltung mit Restriktionsenzymen oder durch PCR) oder Proteinen nach Größe in einer eng vernetzten, gelee-artigen Substanz (Gel). Von einem gemeinsamen Startpunkt aus lässt man die Biomoleküle in einem elektrischen Feld durch das Gel wandern und färbt sie nach
Beendigung der Trennung mit bestimmten Farbstoffen an. Moleküle gleicher Größe können einer gemeinsamen Wanderungsfront („Bande“) zugeordnet werden. Bei komplexen Substanzgemischen werden im Anschluss daran oft weitere Nachweisverfahren geführt, z. B. mit markierten Antikörpern (Eiweißstoffen des Immunsystems) gegen ein gewünschtes Protein oder markierten DNA-„Sonden“ gegen einen gesuchten DNA-Abschnitt.
Sequenzierung
Mit dieser Methode wird die endgültige Analyse gesuchter Gene oder ihrer Veränderungen durch Bestimmung der genauen Basenabfolge auf der DNA möglich. Die ersten Sequenzierungsverfahren ab 1977 wurden chemisch durchgeführt und später um enzymatische Methoden ergänzt. Grundprinzip ist die Erzeugung von DNA-Fragmenten, die jeweils mit einer der vier Basen enden. Um die Analyse zu erleichtern, werden die Fragmente mit radioaktiven Substanzen oder mit leuchtenden Farbstoffen markiert und anschließend elektrophoretisch nach Größe getrennt. Das entstehende „Leitermuster“ kann auf einem Röntgenfilm bzw. durch optische Messverfahren sichtbar gemacht und halbautomatisiert oder automatisiert ausgewertet werden. Die Erfindung und Weiterentwicklung dieser Methode hat die Weichen für die moderne Genomforschung gestellt.
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 DNA-Sequenz nach radioaktiver Markierung auf einem Röntgenfilm |